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RIFRAZIONE FRONTALE ("Forward Scatter") La rifrazione frontale è misurata da un fotodiodo posto frontalmente al percorso ottico della luce laser. Quando il raggio luminoso monocromatico colpisce le cellule, una parte dei suoi raggi viene deviata in diverse direzioni e angolazioni. La quantità di luce che riesce a raggiungere il fotodiodo rilevatore è direttamente proporzionale alle dimensioni (volume) della cellula. La misura di rifrazione frontale è utilizzata dai sistemi Sysmex per l'analisi di:
- Globuli Bianchi e Granulociti Basofili (canale WBC/BASO)
- Reticolociti e Piastrine (canale RET/PLT-O)
- Eritroblasti (canale NRBC).
RIFRAZIONE LATERALE ("Side Scatter")
La rifrazione laterale è rilevata da un tubo fotomoltiplicatore posto in posizione ortogonale alla sorgente luminosa. Esso quindi raccoglie in modo selettivo, per mezzo di uno specchio dicroico, la luce diffratta da ciascuna cellula ad un angolo di 90 gradi rispetto alla luce incidente. A tale angolazione la luce rifratta dalla cellula dipende da:
- Regolarità di forma del nucleo
- Densità della cromatina nucleare
- Granularità del citoplasma
La quantità di luce rifratta lateralmente da un granulocita, pertanto, è molto più elevata della quantità di luce rifratta da un linfocita per la maggiore quantità di granulazioni citoplasmatiche e la maggiore irregolarità di forma del nucleo.
La misura di rifrazione laterale e utilizzata dai sistemi Sysmex per l'analisi di:
- formula leucocitaria (canale DIFF)
- Globuli Bianchi e Granulociti Basofili (WBC/BASO)
FLUORESCENZA ("Side Fluorescence")
La coniugazione di specifici fluorocromi a particolari componenti chimici o strutturali delle cellule (proteine, materiale nucleare) consente di differenziare in modo accurato e sensibile le diverse popolazioni cellulari. Un fluorocromo, quando è eccitato da una luce monocromatica di idonea lunghezza d'onda, è in grado di emettere un raggio luminoso a una frequenza minore.
Quindi, dopo essersi legato allo specifico componente cellulare, il colorante fluorescente emetterà in tutte le direzioni dello spazio una luce di lunghezza d'onda maggiore.
Un tubo fotomoltiplicatore (posto ad un angolo di 90 gradi rispetto alla sorgente di luce laser) rileva la quantita di luce fluorescente emessa da ciascuna cellula, trasformandola in un segnale elettrico. Per rendere più sensibile e accurata tale misurazione, il tubo fotomoltiplicatore è preceduto da un filtro ottico che seleziona la lunghezza d'onda caratteristica del fluorocromo in esame.
La misura di fluorescenza è utilizzata dai sistemi Sysmex per l'analisi di:
- formula leucocitaria (canale DIFF)
- eritroblasti (canale NRBC)
- reticolociti e piastrine (canale RET/PLT-O)
Per ciascuna analisi viene utilizzato uno specifico colorante polimetinico in grado di coniugarsi al DNA e all'RNA contenuto nel nucleo e negli organuli citoplasmatici.
L'intensità di fluorescenza emessa da ciascuna cellula, combinata alla quantità di luce rifratta lateralmente e/o frontalmente consente una eccellente classificazione delle diverse popolazioni cellulari del sangue e, all'interno della stessa popolazione, un ulteriore e più specifica classificazione in base al grado di immaturità cellulare.
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