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Per l'analisi di formula leucocitaria viene utilizzato uno specifico colorante polimetinico in grado di coniugarsi e marcare il DNA e l'RNA contenuti nel nucleo e negli organuli citoplasmatici dei leucociti. Il fluorocromo penetra all'interno delle cellule grazie all'azione combinata di un secondo reagente (Lisante 4 DL), in grado di permeabilizzare la membrana citoplasmatica dei leucociti e di lisare in modo completo i Globuli Rossi e le Piastrine.
Un acido organico, contenuto nel reagente Lisante 4 DL, si lega specificamente ai granuli presenti negli Eosinofili.
Il campione viene quindi inviato nel banco ottico di lettura per la rilevazione multiparametrica della rifrazione laterale di luce laser (Side Scatter) e dell'intensità di fluorescenza (Side Fluorescence). L'intensità del segnale di Side Scatter dipende dalla complessita del nucleo e dalla presenza di granuli nel citoplasma. Maggiore è la complessità del nucleo ed il numero di granuli presenti, più elevata sarà l'intensità del segnale di Side Scatter. L'intensità del segnale di Side Fluorescence dipende dalla quantità di acidi nucleici contenuti nella cellula. Tanto maggiore è la quantità di acidi nucleici, tanto più elevata sarà l'intensità del segnale di Side Fluorescence. Le informazioni ottenute dall'analisi citofluorimetrica sono visualizzate nel citogramma DIFF. Ciascuna popolazione leucocitaria è rappresentata con uno specifico codice colore: Linfociti in viola, Monociti in verde, Neutrofili in azzurro, Eosinofili in arancione. I Basofili vengono analizzati direttamente nel canale WBC/BASO. Le popolazioni leucocitarie sono separate in base ai seguenti criteri:
- L'intensità del segnale di Side Scatter, asse X del citogramma, distingue nettamente gli elementi Mononucleati (Linfociti + Monociti) dai Polimorfonucleati (Granulociti Neutrofili+Basofili ed Eosinofili).
- I granulociti Eosinofili sono separati dai Neutrofili per la maggiore intensità del segnale di Side Scatter, in virtù della struttura cristallina dei loro granuli e dalla colorazione assunta con il colorante organico
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